共聚焦成像——如何讓細胞在玻璃底培養皿更好地貼壁

 很多童學做共聚焦成像的時候都會遇到細胞貼壁難的問題。今天分享下如何處理玻璃底培養皿、如何選擇玻璃底培養皿，讓細胞妥妥地貼壁，大家做共聚焦時候能夠更得心應手。

   市面上常見的玻璃底培養皿，通常是在塑料培養皿底部打個洞，再將厚度為170-220μm的蓋玻片或細胞爬片用無影膠水或硅膠粘于培養皿底部。并不是整個培養皿的底部都是玻璃材質的。適用于觀測的區域僅僅在打孔的區域。但是由于玻璃的疏水性，往往在培養細胞的時候，細胞不能在玻璃上很好地貼壁，生長狀態并不好，甚至在做共聚焦掃描成像的時候發生細胞脫片現象。

 圖1  市面常見玻璃底培養皿

    想要細胞好好貼壁，所使用的玻璃底培養皿進行細胞培養之前，要確認已經包被了特定的蛋白試劑。

自己動手包被

     培養不同的細胞，需要的包被試劑也不同。同時，因為用于包被的蛋白是生物產物，所以不同公司的包被蛋白的產品純度和用量都是不同的，本技術帖只是提供參考，具體的包被試劑用量還是要參考所用品牌的說明書。并且盡量以自己所用的試劑先做一個梯度實驗，找出適合的包被濃度。

     這里以 Poly-L-Lysine 為例（PLL，sigma，P4832, 100μg/ml）：

   PLL包被適用于絕大多數細胞，尤其適用于中樞系統神經元的培養。在使用時需要使單位面積上的蛋白含量（μg/cm2）達到理想的量。本例中PLL推薦包被的用量為 2μg/cm2。需要根據包被面積，包被體積，來計算所需要蛋白質的量。

    比如：35mm玻璃底培養皿，細胞生長面積是3.5cm2，包被面積是4.1cm2，包被液體積是400μl，那根據推薦用量2μg/cm2。那么單孔中需要8.2μg的PLL，如果只加入400μl的PLL溶液，那PLL的溶液濃度為20.5μg/ml（約為 20μg/ml）。所以，需要用超純水將原液進行稀釋。

具體步驟：

1.使用超純水按照1:5稀釋PLL原液。

2.在每個35mm玻璃底培養皿中加入400μl的PLL稀釋液。

3.室溫孵育1-2小時，吸出PLL稀釋液。

4.使用2ml PBS溶液或無血清培養基小心的清洗3次，吸盡清洗液。

5.直接加入細胞懸液進行培養。

方法評價

    由于各種包被蛋白的性質不同，不同的包被蛋白使用方法也不一樣。經常由于需要對玻璃底培養皿包被，而產生了新的污染。而且污染往往是開始養細胞了以后才會發現，這樣不僅耽誤了時間，而且也浪費了試劑盒耗材。畢竟包被蛋白試劑和質量有保證的玻璃底培養皿價格也是不菲的（質量不過關的玻璃底培養皿有可能會因為膠水沒有粘勻而漏液或者使用的膠水對細胞有毒性）。

無需包被的共聚焦培養皿

      對于想節省時間和功夫的童鞋，還是直接使用無需包被的共聚焦培養皿更為方便些。

     選擇合適的培養皿需要考慮的因素有：是否適合自己的細胞貼壁、培養皿的光學特性是否符合共聚焦要求。

     能符合上述因素要求的培養皿，不局限于帶包被的玻璃底培養皿，事實上，大家都知道塑料培養皿更便宜、相對玻璃來說，也更容易讓細胞貼壁。這里以德國ibidi的共聚焦培養皿為例，說一下符合共聚焦實驗的培養皿需要具備哪些參數：

很多童學做共聚焦成像的時候都會遇到細胞貼壁難的問題。今天分享下如何處理玻璃底培養皿、如何選擇玻璃底培養皿，讓細胞妥妥地貼壁，大家做共聚焦時候能夠更得心應手。

   市面上常見的玻璃底培養皿，通常是在塑料培養皿底部打個洞，再將厚度為170-220μm的蓋玻片或細胞爬片用無影膠水或硅膠粘于培養皿底部。并不是整個培養皿的底部都是玻璃材質的。適用于觀測的區域僅僅在打孔的區域。但是由于玻璃的疏水性，往往在培養細胞的時候，細胞不能在玻璃上很好地貼壁，生長狀態并不好，甚至在做共聚焦掃描成像的時候發生細胞脫片的現象。

圖2  德國ibidi共聚焦培養皿和高質量玻璃底培養皿的底部參數對比

      可以看出，符合直接使用要求的共聚焦培養皿，它們的物理參數都是非常接近玻璃的，但同時，它們又還具有親水的特性，能讓大多數細胞更好貼壁；而且透氣性和延展性都要比玻璃更好。比如這里舉例的ibidi培養皿，就可讓絕大多數細胞系和原代細胞直接貼壁生長，而且不易碎，算是不錯的選擇。

   大家也可根據自己具體實驗要求，結合上述表格的參數，找到合適自己實驗的共聚焦培養皿。

方法評價

     選擇這類培養皿，不需要額外包被，大大減少了污染的風險。并且由于塑料底部比較易于加工，不需要膠水就能使其固定在培養皿底部。杜絕了漏液或者細胞毒性的可能。

高通量共聚焦實驗耗材

  由于單個培養皿通量很小，如果一次要做多個樣品，操作就會比較麻煩，且試劑用量會較大，這時候可以選擇多孔的耗材，比如腔室載玻片（2/4/8孔），可以滿足研究人員需要一次進行多通量的成像。并且相對于傳統的共聚焦培養皿，腔室載玻片需要試劑的更少，非常節約價格昂貴的抗體，單孔實驗的成本大大降低。

圖3市面的無需包被共聚焦培養皿和腔室載玻片

現在也有適用于高內涵顯微鏡和活細胞工作站的多孔板。適合全自動成像和操作。

圖4市面的高內涵顯微鏡和活細胞工作站的多孔板

（圖片引用自德國ibidi的82406，89626；這個多孔板的壁是黑色的，可以避免成像時候孔間熒光的影響，不錯的設計。贊一個～）

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