不同細胞類型的細胞接種密度特征（見第 4.1.2 節）

　　1.介紹

血管生成實驗是篩選物質以發現它們對培養細胞的抗或促血管生成作用的有力工具。通過比較用物質處理的細胞與對照細胞培養物，物質的效果可以通過管長和凝膠（即 MatrigelTM值）表面形成的環數等參數來衡量。

進行血管生成分析需要優化實驗方案并建立提供可靠數據采集方法。實驗設置的三個關鍵組成部分是數據采集時間點、細胞接種密度和細胞培養基的血清濃度。

本應用將幫助使用您自己的細胞系優化試管形成分析的實驗設置，確保可靠的數據采集和可重現的結果。

在本應用簡報的某些部分，我們討論了ibidi µ-Slide 血管生成，但在任何容器中進行的管形成分析都將顯示相同的特征，并且可以以相同的方式處理數據。

µ-Slide 血管生成載玻片

　　2.選擇正確實驗方案

進行血管形成分析的第一步是確定實驗方案。三個最重要的考慮因素是：

· 細胞類型——內皮細胞中生理性地觀察到管形成

· 凝膠基質——它需要與細胞相容，并且必須為細胞附著提供結合基序

· 培養基成分（要求生長因子？）

適用于大多數內皮細胞的設置包括MatrigelTM、減少生長因子和含 2% 或更少血清的內皮細胞培養基。

　　3.數據分析概述

為了更好地理解優化的后續步驟，需要對數據分析參數進行概述。

如下圖所示的顯微圖像顯示了具有四個可檢測關鍵參數管狀網絡：

· 細胞覆蓋區域（藍色）

· 管（紅色）

· 循環（黃色）

· 分支點（白色）

可以從這些參數計算其他值，例如平均管長度、總管長度和平均環路面積。

圖1，管形成分析的關鍵指標

有幾種方法可以執行圖像分析。一種方法是使用圖像處理軟件手動執行此操作，例如 ImageJ“血管生成分析器”。

另一種選擇是使用自動圖像分析平臺，例如ACAS.

　4.實驗前工作

在開始篩選實驗之前，必要優化實驗程序和設置。
　　
4.1. 實驗裝置的優化

細胞接種密度、數據采集時間點和血清濃度對數據值有很大影響。因此，創建嚴格對于生成可重復的數據和數據集之間的可比性至關重要。

　　4.1.1. 測量時間間隔

首先，選擇細胞濃度和促進血管形成的設置來記錄時間曲線。對于人臍靜脈內皮細胞 (HUVEC) 每孔約 10,000 個細胞，使用具有減少生長因子的基質膠TM值和不含血清或生長因子的細胞培養基就足夠了。

接下來，按照應用說明制備凝膠和細胞懸液，“ibidi µ-Slide 血管生成的形成分析”。在凝膠表面播種細胞后，立即將載玻片放入顯微鏡的培養室中，并開始延時記錄。每 10 分鐘記錄一張圖像，使用基于軟件的工具在每個時間點調整焦點。或者，如果您的顯微鏡上沒有孵化室，則每小時記錄一次圖像，至少在前 8 - 10 小時內。記錄每個圖像后立即將樣品放入細胞培養箱中。在過夜培養后記錄最終圖像。

最后，分析圖像并使用合適的軟件可視化曲線。參數（例如，總管長）的時間曲線通常如下圖所示。曲線上升到最大值（約 5 小時），然后下降到平均期（約 7 小時開始），然后慢慢變平（> 20 小時）。由于所有四個關鍵參數的特征看起來相似，只評估一個參數就足夠了。我們選擇管總長度作為參數，因為原始圖像提供了一個控制，可以輕松地與評估圖像進行比較。

圖2，24小時內管長的時間響應

最佳結果出現在最大階段以及不會迅速下降的穩定階段。在上例中，4 小時時間點和 10 小時時間點是很好的測量參考點。

　　4.1.2. 細胞接種密度

要確定最佳細胞接種密度，請記錄細胞系的特征。

首先，在 5-40 x 10 3cells/ml 范圍內進行一系列稀釋，然后將細胞接種到凝膠表面。按照第 4.1.1 節中的說明將樣品孵育確定的時間長度，并記錄相襯圖像。每個細胞濃度執行五次重復。

評估圖像，分別在第 3 節和第 5 節中提到。將數據可視化為圖表，如下所示。數據將顯示具有最大值的特性曲線。該最大值是您的細胞類型的最佳接種密度。

圖3，HUVEC 和 EA.hy926接種4小時后的密度響應

4.1.3. 血清濃度

向培養基中添加血清可能會影響試管形成行為。在大多數情況下，血清抑制管形成。為避免此問題，請使用您在第 4.1.1 節和第 4.1.2 節中確定的條件測試不同的血清濃度，范圍為 0 - 20%。這將確定哪種血清濃度最適合血管生成和細胞存活。

　　4.1.4. 放大倍數

放大倍數決定了能夠被相機成像的孔區域。由于管的形成發生在孔的整個表面區域，重要的是盡可能地對最寬的部分進行成像。如果不需要檢測細胞內細節，請使用低倍率（4 倍或 5 倍）。如果需要檢測細胞內細節，建議對每個孔拍攝幾張放大倍數更高的圖像并將它們拼接在一起

　4.2. 建立陽性和陰性對照

要創建陽性對照，請選擇確保血管形成的實驗系統（例如，具有減少生長因子的基質膠TM值和用于 HUVEC 的無血清培養基）。陽性對照確保細胞是健康的，并且觀察到的任何抗血管生成作用都是由所研究的物質引起的。

要創建陰性對照，請選擇一種經證實對血管形成發展具有抑制作用的物質（例如，用于 HUVEC 的蘇拉胺）。陰性對照確保可以抑制細胞中的管形成，并為您的實驗結果提供一個比較點。

4.3. 實驗計劃和重復次數

在進行實驗之前，計算所需材料的數量，例如細胞、培養基、凝膠基質和物質。還要計算實驗室設備和空間要求以及時間表。

為了正確地進行統計分析，建議至少進行四次獨立實驗，每個實驗至少有 8 個單孔。所需的實驗次數取決于數據的均勻性。遵循嚴格的協議對于數據采集至關重要。

對數據集執行學生 T 檢驗。p 值 ≤ 0.05* (≤ 0.01**) 表示該模型有足夠的功效，無需額外實驗即可繼續。

　　4.4. 文檔

合理的文檔包括本節中確定的所有參數。生成一個表格圖表，其中每個實驗都記錄在一列中。附錄中給出了一個例子。

　　5.數據分析

每個分析孔生成一個管長度值。然后將一個實驗（每個條件至少 8 個孔）的值相加并計算標準偏差。標準偏差應小于 10%。這只是一個實驗數據點。　

左圖顯示了在四個不同時間點，一種實驗條件下單孔結果的分布。右圖顯示了一種實驗條件在四個不同時間點的平均結果。

為了正確穩定的統計分析，每個條件至少需要四個數據點。請記住，每個數據點由 8 個單獨的孔組成。

單個數據點合并為一個平均值，并可以顯示在條形圖中。統計分析是通過學生 T 檢驗完成的，其中對不同的數據點群體進行相互檢驗。

　　
6.數據解讀

學生的 T 檢驗提供了兩個單獨的數據集是否具有 t 分布值的證據，表明彼此之間存在統計學上的顯著差異。實驗中的重復次數和實驗次數會影響分析。學生 T 檢驗可以使用統計分析軟件（即 SAS）或 Microsoft® Excel® 進行。

重要的是要考慮可以使用管形成數據實際預測的內容。管的形成是一個非常復雜的過程，它結合了各種各樣的生化反應和途徑。我們認為，該實驗裝置適用于篩選物質并提供有關物質抗促血管生成作用的初步預測。它沒有解釋任何觀察到的效果是如何工作的。需要額外的生化分析來確定這一點。