本應(yīng)用是在 µ-Slide Spheroid Perfusion 中對球體進行熒光染色的示例。

我們使用熒光素二乙酸酯 (FDA) 和碘化丙啶 (PI)，這是用于分別區(qū)分活細胞和死細胞的標準染色。FDA 被活細胞吸收，將非熒光 FDA 轉(zhuǎn)化為綠色熒光代謝物熒光素。測量的信號用作活細胞的指標，因為轉(zhuǎn)化是酯酶依賴性的。相比之下，細胞核染色染料 PI 不能通過活細胞的細胞膜。只有在死細胞中，它通過無序的細胞膜區(qū)域到達細胞核，并插入細胞的 DNA 雙螺旋。

同時使用這兩種熒光染料可以輕松區(qū)分 3D 球體中的活細胞和死細胞群。

重要提示：

與標準方案相比，使用 µ-Slide Spheroid Perfusion 進行染色需要更多的孵育時間和更多的洗滌步驟。這是為了確保染料和抗體充分擴散到利基區(qū)域。

相關(guān)文件：

在球體灌注載玻片中生成L929球體并進行動態(tài)培養(yǎng)實驗

關(guān)鍵詞：

熒光顯微鏡、活細胞成像、活/死細胞染色、二乙酸熒光素 (FDA)、碘化丙啶 (PI)

材料:

· μ-Slide Spheroid Perfusion Bioinert (80350, ibidi, Germany) 用于 L929 球體制備，見上面相關(guān)文件內(nèi)容詳情

· PI（CN74.2， Carl Roth）

· FDA (F7378, Sigma Aldrich)

· 細胞培養(yǎng)基（21875034，RPMI-1640，Gibco）

· 帶有合適濾光片組的熒光顯微鏡

染色:

· 在無血清細胞培養(yǎng)基中制備染色溶液，以獲得 PI 的最終濃度：200 µg/ml 和 FDA：80 µg/ml。

· 根據(jù)說明進行培養(yǎng)基更換并填充染色溶液。

· 在 37°C 和 5% CO2下孵育 30 分鐘。

· 進行培養(yǎng)基交換并填充細胞培養(yǎng)基。此洗滌步驟將去除染色溶液。洗三遍。在每個洗滌步驟之間等待 10 分鐘。

成像-結(jié)果:

· 用合適的濾片組在熒光顯微鏡下觀察細胞。

· 或者，疊加圖像以創(chuàng)建合并圖像。

使用 ibidi 泵系統(tǒng)以 0.75 毫升/分鐘灌注培養(yǎng) 14 天后，在 µ-Slide 球體灌注中用FDA/PI對 L929 球體進行活/死染色，Bioinert。綠色：活細胞（二乙酸熒光素，F(xiàn)DA）；紅色：死細胞（碘化丙啶，PI）。寬場熒光顯微鏡，10x 物鏡。