AnielloFederico*,JochenUtikalSkinCancerUnit,GermanCancerResearchCenter(DKFZ),69120Heidelberg,Germany.*Correspondingauthor.E-mailaddress:a.federico@dkfz-heidelberg.de

　　為了研究腫瘤微環境影響下腫瘤細胞的運動性和侵襲特性，建立了體外2D侵襲方案。這種2D侵襲方案是一種共培養試驗，在這種情況下，是由腫瘤和基質細胞（例如成纖維細胞）組成的。一旦兩種細胞類型接觸，在不同的條件下評估侵襲成纖維細胞單層的腫瘤細胞的數量，在我們的研究中，我們在模擬實體腫瘤微環境中發現的條件，例如與基質細胞（成纖維細胞）的相互作用以及成纖維細胞釋放的可溶性因子（Nnetu等，2012）。我們使用A375黑色素瘤細胞系和真皮成纖維細胞進行了此測定。黑色素瘤細胞激活成纖維細胞，繼而維持腫瘤細胞的生長，惡性轉化和耐藥性（Flach等，2011）。然而，在刺激所測試的抗癌化合物后，我們發現與成纖維細胞直接接觸的黑素瘤細胞顯示出運動能力受損并且未能侵襲成纖維細胞層。

　　材料和試劑

　　1. GFP-A375細胞系（ATCC）

　　2. 番茄皮成纖維細胞（從健康患者中分離）

　　3. MEF細胞培養基

　　4.PBS（Sigma-Aldrich；D8537）

　　5.胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich；T3924）

　　6. 臺盼藍溶液（Sigma-Aldrich;93595）

　　7.DMSO（CarlRoth;A994.2），在0.1％最終濃度下使用

　　8.MithramycinA（BioTrend；10-2085-5mg），在300nm濃度下使用，用DMSO稀釋

　　儀器設備

　　1. 層流凈化罩

　　2. 12/24孔多孔板（GreinerBio-One）

　　3. 臺式離心機

　　4. 細胞計數器

　　5. 2孔插件（ibidi: 80209）/預置2孔插件培養皿（ibidi:81176）

　　6.細胞培養管

　　7. 渦旋

　　8. 鑷子

　　9. 光學顯微鏡

　　10. 熒光顯微鏡

　　11. NIS-Elements軟件

ibidi:81176

　　實驗流程

　　01. 將GFP-A375和番茄成纖維細胞系穩定地保存在MEF培養基中，在37°C和5%C02加濕培養箱中。

　　02. 當細胞達到亞融合度（約80％融合度）時，在帶有PBS的通風櫥中清洗它們，以去除死細胞和碎片。

　　03. 在培養箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化細胞約5分鐘，然后添加MEF培養基以阻止反應。

　　04. 將細胞懸浮液收集在15ml細胞培養管中，并用臺式離心機（1500xg,5´,RT）短暫離心。

　　05. 將細胞重新懸浮在新鮮培養基中；將一體積的細胞懸液與另一體積的臺盼藍溶液混合，用細胞計數器計數活細胞。

　　06. 在MEF緩沖液中以4x105細胞/ml的濃度稀釋細胞。

　　07. 在多孔板上，在每個孔的中間放置一個Culture-Insert2孔（2孔培養插件）。

　　08. 用75µl（3x104細胞）FP-A375細胞填充插入物一側，并用番茄成纖維細胞填充另一側。用移液器上下混合插入物中的細胞，以確保細胞完全分布。

　　09. 將多孔板放在培養箱中，放置過夜。

　　10. 第二天，在鑷子的幫助下，小心地從每孔中取出培養基和插件，并用PBS清洗。

　　11. 小心除去PBS，然后加入新鮮的MEF培養基。

　　12. 用光學顯微鏡檢查GPF-A375與Tomto成纖維細胞之間產生的間隙的閉合狀態。

　　13. 一旦每個孔中的間隙完全閉合，請使用熒光顯微鏡和成像軟件獲取熒光圖像。確保腫瘤細胞尚未侵入成纖維細胞單層。

　　14. 小心地除去培養基，并在控制組孔中添加培養基+0.1％PBS，在處理組孔中添加培養基+300nM絲裂霉素A。將板放在培養箱中24小時（處理孵育時間）。

　　24小時后，在熒光顯微鏡下重新采集共培養孔，以評估治療組與對照組（綠色熒光細胞散布在紅色標記層上）的腫瘤細胞侵襲行為的任何變化（圖2）。

圖1：2D侵襲系統的示意圖

圖2：2D侵襲檢測的熒光圖像

　　將黑素瘤細胞和成纖維細胞共培養，然后暴露于300nmMithramycinA（或DMSO）。24小時后，評估侵襲成纖維細胞層的腫瘤細胞的數目。A375細胞顯示出大規模的侵襲行為，受到MithramycinA治療的損害。比例尺：500μm。

　　備注：

　　1.此處描述了MEF培養基組成（參考文獻1）。

　　2.此文僅供參考。

　　3.此實驗方案來自ibidi的實際用戶，更多詳情可聯系本文作者。

　　參考文獻：

　　1.MithramycinAandmithralogEC-8042inhibitSETDB1expressionanditsoncogenicactivityinmalignantmelanoma. FedericoA,SteinfassT,LarribèreL,NovakD,MorísF,NúñezLE,UmanskyV,UtikalJ.MolelucarTherapy-Oncolytics2020;doi: https://doi.org/10.1016/j.omto.2020.06.001 (Methoddescribedinthisprotocolwasincludedinthispublishedarticle).

　　2.Theimpactofjammingonboundariesofcollectivelymovingweak-interactingcells. NnetuKD,KnorrM,KäsJ,ZinkM.NewJournalofPhysics2012;doi:https://doi.org/10.1088%2F1367-2630%2F14%2F11%2F115012

　　3.Fibroblastscontributetomelanomatumorgrowthanddrugresistance. FlachEH,RebeccaVW,HerlynM,SmalleyKS,AndersonAR.Molecular pharmaceutics2011;doi:10.1021/mp200421k