小鼠 L929 成纖維細胞的多細胞球體是在µ-Slide 球體灌注中創(chuàng)建的。在從細胞懸浮液中形成球體后，使用 ibidi 泵系統進行灌注。添加 ibidi Pump 可確保球體在長期培養(yǎng)過程中獲得最佳營養(yǎng)。

　　

　　在灌注培養(yǎng) 1 周后，將球體固定并用鬼筆環(huán)肽染色以觀察 F-肌動蛋白細胞骨架。最后，球體被清除以增強成像深度和分辨率。我們使用EMOVI 方法進行具有成本效益、無害的整體成像，這可以在固定球體上實現基于抗體的多重免疫標記。球體的清除允許分析整個球體成纖維細胞甚至在球體成纖維細胞中心的成纖維細胞的分布和組織，同時保留球體的形態(tài)

　　

　　01材料和試劑

　　

　　細胞和試劑

　　

　　•L929成纖維細胞（DSMZ，編號ACC 2）

　　

　　•Accutase(A1110501,Gibco)

　　

　　•細胞培養(yǎng)基 RPMI-1640 (Gibco, 21875034)

　　

　　•胎牛血清 (FCS, Gibco, 10270106)

　　

　　•細胞內 (IC) 固定緩沖液 (eBioscience, 00-8222-49)

　　

　　•Dulbecco 磷酸鹽緩沖液（PBS、Sigma、D8537）

　　

　　•正常小鼠血清（Jackson，015-000-120）

　　

　　•正常驢血清（Jackson，AB_2337258）

　　

　　•Triton X-100（Alfa Aesar，A16046）

　　

　　•Flash Phalloidin™ Green 488（鬼筆環(huán)肽；500x，Thermo Fisher Scientific，46410）

　　

　　•4'，6-二脒-2-苯基吲哚（DAPI，濃度20μg/mL，西格瑪奧德里奇，D9542）

　　

　　•去離子水 (diH2O)

　　

　　•異丙醇（Carl Roth，CP41.2）

　　

　　•肉桂酸乙酯 (ECi) (Sigma, W243000)

　　

　　02緩沖液和溶液

　　

　　培養(yǎng)基

　　

　　•新鮮制備并在 4°C下儲存長達一周

　　

　　•基礎培養(yǎng)基 RPMI-1640 (Gibco, 21875034)

　　

　　•10%  FCS （ Gibco，10270106）

　　

　　封閉和染色緩沖液

　　

　　•PBS 

　　

　　•1% （v/v）FCS 

　　

　　•1% (v/v) 正常小鼠血清

　　

　　•1% (v/v) 正常山羊血清

　　

　　•0.3% (v/v) Triton  X-100

　　

　　染色液

　　

　　•封閉和染色緩沖液

　　

　　•1:500 鬼筆環(huán)肽（最終濃度 1x）

　　

　　•1:10 DAPI（最終濃度 2 µg/mL）

　　

　　30% / 50% / 70% (v/v) 異丙醇稀釋液

　　

　　•混合適當體積的 diH2O 和異丙醇

　　

　　•使用前預冷至 4 °C

　　

　　03 設備   

　　

　　•ibidi 泵系統 (ibidi, 10902)

　　

　　•具有生物惰性表面鈍化的 ibidi µ-Slide 球體灌注（ibidi，80350）

　　

　　•用于 µ-Slide 的 ibidi 串行連接器（ibidi，10830）

　　

　　•ibidi 灌注套裝藍色 (ibidi, 10961)

　　

　　•層流罩

　　

　　•培養(yǎng)箱，37°C 和 5% CO2

　　

　　•血細胞計數器（康寧)

　　

　　•移液器(康寧）

　　

　　•倒置共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8）

　　

　　•徠卡應用套件 X

　　

　　•LIGHTNING（反卷積軟件）

　　

　　•Imaris v9.5

　　

　　04 操作程序

　　

　　第一部分：µ-Slide球體灌注中的球體形成和培養(yǎng)

　　

　　請在使用 µ-Slide Spheroid Perfusion 之前閱讀指示。所有步驟均需在無菌條件下執(zhí)行。

　　

　　開始實驗之前，在標準細胞培養(yǎng)瓶（例如 T75）中制備 L929 成纖維細胞，細胞粘附在底部。細胞在實驗當天應該是健康的并且最佳亞匯合。

　　

　　重要提示：在 37°C 和 5% CO2的培養(yǎng)箱內過夜平衡所有必需的材料，例如載玻片、培養(yǎng)基和管道（灌注套件）。平衡對于防止氣泡隨著時間的推移而出現至關重要。

　　1. 將60 µl 無細胞培養(yǎng)基注入 µ-Slide Spheroid Perfusion 的每個通道（根據說明用提供的蓋玻片封閉）

　　

　　2. 在培養(yǎng)箱中 37°C 孵育 2 小時。孵育期間始終關閉蓋子。

　　

　　3. 用 Accutase 處理培養(yǎng)的 L929 細胞 1-2 分鐘以使其脫離。

　　

　　4. 收集細胞懸液，離心，在培養(yǎng)基中稀釋；量取決于所需的細胞濃度。

　　

　　5. 對細胞計數并調整至終濃度為 5 x 105cells/ml。

　　

　　6. 用無細胞培養(yǎng)基沖洗 µ-Slide 球體灌注的通道，以去除潛在的氣泡。

　　

　　7. 將 45 µl 細胞懸液直接移入每個通道。

　　

　　8. 在 37°C 下孵育 1 小時，使細胞在壁孔中沉淀。

　　

　　9. 用60 µl 無細胞培養(yǎng)基填充 µ-Slide Spheroid Perfusion 的儲液庫。

　　

　　10. 在 37°C 下孵育過夜以形成球體。

　　

　　11. 檢查通道是否有氣泡。如果通道中存在任何氣泡，請用無細胞培養(yǎng)基小心沖洗通道。

　　

　　12. 使用ibidi 串行連接器連接 µ-Slide Spheroid Perfusion 的 3 個通道

　　

　　13. 根據ibidi 泵系統、流體單元和灌注裝置指示.

　　

　　14. 將µ-Slide 球體灌注連接到 ibidi 泵系統并開始流動。使用盡可能低的流速（5 mBar 氣壓導致流速為 0.74 ml/min）。進行實驗，直到球體具有所需的成熟狀態(tài)，在這種條件下培養(yǎng) 7 天后。

　　圖1：L929 成纖維細胞在孔中形成球體并在流動條件下培養(yǎng)

　　圖 2：L929 成纖維細胞在µ-Slide 球體灌注中顯示球體形成。第1 天的示例

　　

　　(A)第 6 天 (B)，使用 ibidi 泵系統灌注，0.74 毫升/分鐘。相差顯微鏡，10 倍物鏡，井徑 800 µm。

　　

　　第二部分：L929 球體的染色和清除

　　

　　染色直接在 µ-Slide Spheroid Perfusion 中進行。在開始染色之前，請閱讀指示并遵循載玻片中關于一般移液和更換溶液的建議。

　　

　　1. 當 L929 球體培養(yǎng)達到所需的成熟狀態(tài)（此處為 7 天后）時，小心地斷開 µ-Slide球體灌注與 ibidi 泵系統的連接。

　　

　　2. 在 RT 處用冷 IC 固定緩沖液固定球體 10 分鐘。

　　

　　3. 在 RT 中將球體封閉和染色緩沖液中孵育 1 小時。

　　

　　4. 在 37°C 下用染色溶液孵育球體過夜。從這一點開始，保持載玻片避光。圖 3A 顯示了清除前的球體成像。

　　

　　5. 第二天，用 Blocking and Staining Buffer 清洗細胞一次。

　　

　　6. 通過在冰上以上升 30%、50% 和 70% 的異丙醇稀釋液孵育15 分鐘，依次使球體脫水。

　　

　　7.  在冰上用純異丙醇孵育球體兩次 15 分鐘。

　　

　　8.  從冰中取出載玻片，讓它升溫至 RT。

　　

　　9.  執(zhí)行清除：在 RT 處用純 ECi 灌注兩次。在這個階段，球體可以避光儲存數周，而不會顯著損失熒光。

　　

　　10.  使用共聚焦顯微鏡的圖像球體（參見圖 3）。

　　圖 3：清除前后染色 L929 球體的共聚焦顯微鏡（紅色：鬼筆環(huán)肽，青色：DAPI）。

　　

　　(A) 清除前的球體。請注意，由于光散射和吸收，只能看到外圍細胞，而看不到中心的細胞。(B, C) 清除后的球體。請注意，清洗前后的尺寸差異源于脫水和清洗過程，同一位置的橫截面。(B) 橫截面 (C) 體積/3D 視圖。球體的清除允許即使在球體成纖維細胞的中心也可以看到細胞，同時保留球體的形態(tài)。細胞核的計數甚至可以確定形成該球體的細胞數。

　　

　　點擊請查看清除前后染色球體的直接對比視頻 (z-stack of 440 slices at a slice spacing of 0.36 µm)。

　　注：此實驗方案來自ibidi的實際用戶，更多詳情可聯系本文作者E-mail address: selina.keppler@tum.de

　　

　　僅供科研使用！