細(xì)胞生物學(xué)是生命科學(xué)的一門學(xué)科。顧名思義，它致力于研究生物。單憑這一事實就足以成為研究細(xì)胞自然生存狀態(tài)的理由。當(dāng)然，活細(xì)胞成像還有其他深層次的原因。在本篇文章中，我們列舉了用延時顯微鏡研究活細(xì)胞是有意義的五大很好的理由。

　　背景

　　活細(xì)胞成像允許在一定時間內(nèi)在顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)觀察。各種顯微鏡技術(shù)適用于活細(xì)胞成像：例如，可以采用無標(biāo)記的技術(shù)，如相差，DIC，或干涉測量法，也可以依靠熒光顯微鏡，利用熒光標(biāo)記標(biāo)記和可視化細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)、分子或蛋白質(zhì)。當(dāng)然，活細(xì)胞成像也面臨挑戰(zhàn)，在建立活細(xì)胞圖像實驗時需要考慮某些要求。最重要的是，必須確保顯微鏡配備了一個stage top 培養(yǎng)箱，能夠提供理想的環(huán)境，使細(xì)胞在一段時間內(nèi)保持存活和健康。

圖1.A：活細(xì)胞成像過程中需要考慮和控制的環(huán)境參數(shù)

圖1.B：倒置顯微鏡的臺頂培養(yǎng)箱示意圖

　　參數(shù)和環(huán)境條件是此類實驗的重要部分，我們將在以后的公眾號中討論。如果您有興趣，可以在本篇文章中查看更多相關(guān)內(nèi)容。在此我們已經(jīng)介紹了基本知識，接下來我們將繼續(xù)深入探討為什么您應(yīng)該使用活細(xì)胞成像來研究您的細(xì)胞：

　　1.避免固定過程中的人工制品

　　細(xì)胞通常在顯微鏡觀察前固定（如免疫熒光），以保存在逼真的狀態(tài)。多年來，許多不同的化學(xué)和物理程序已被優(yōu)化和建立，以保持原始樣品的質(zhì)量。然而，固定過程會對細(xì)胞造成損害（當(dāng)然在這個過程之后，它們會死亡），并不可逆轉(zhuǎn)地改變其組織、結(jié)構(gòu)和形態(tài)（細(xì)胞器收縮、蛋白質(zhì)定位錯誤等）。然而，活細(xì)胞成像可以讓我們研究活細(xì)胞。這意味著他們應(yīng)該展示他們的自然形態(tài)，這仍然會受到熒光標(biāo)簽、激光等的影響，但這就像環(huán)境條件一樣，是一個不同的狀況。

　　2.觀察和分析動態(tài)過程

　　活細(xì)胞成像使我們能夠觀察整個細(xì)胞群、單個細(xì)胞甚至亞細(xì)胞水平的動態(tài)事件。當(dāng)固定細(xì)胞將其鎖定在特定時間點的特定（行為或結(jié)構(gòu)）狀態(tài)時，對活細(xì)胞的顯微鏡觀察可以洞察整個動態(tài)過程。基于功能性細(xì)胞的檢測，如損傷和遷移（圖2）或趨化實驗是活細(xì)胞成像應(yīng)用的很好的例子。這些分析使得研究細(xì)胞對化學(xué)（趨化性）或機械（傷口愈合）刺激的反應(yīng)成為可能。

圖2：使用ibidi Stage Top孵育系統(tǒng)的活細(xì)胞成像顯示了傷口愈合和遷移試驗中MCF7細(xì)胞的間隙閉合。相差；10倍物鏡。

　　3.實時跟蹤細(xì)胞變化

　　活細(xì)胞顯微鏡是實時了解細(xì)胞隨時空變化的一種有價值的方法，而不是依賴于固定細(xì)胞的端點的分析結(jié)果。通過使用延時視頻顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行更長時間的跟蹤，可以捕捉到結(jié)構(gòu)重排的動態(tài)(如圖3，感受趨化刺激后細(xì)胞骨架的極化), 或使用固定細(xì)胞可能會錯過的瞬時細(xì)胞性活動(如，有絲分裂期間的染色體分離)。

圖3：應(yīng)用趨化梯度后，表達(dá)LifeAct的原代樹突狀小鼠細(xì)胞中肌動蛋白動力學(xué)的活細(xì)胞成像

　　4. 研究單分子動力學(xué)、定位和相互作用

　　先進(jìn)熒光標(biāo)記和成像技術(shù)的發(fā)展，如光脫色熒光恢復(fù)技術(shù)（FRAP）、熒光壽命成像顯微技術(shù)（FLIM）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET），使活細(xì)胞成像過程中單分子定位、動力學(xué)和相互作用的觀察和分析成為可能。

　　FRAP可以測量活細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記分子和蛋白質(zhì)的遷移率。FLIM通過測量附著的熒光團(tuán)的壽命來提供有關(guān)細(xì)胞分子分布及其環(huán)境的信息。

　　利用FRET，人們可以通過檢測兩個分子在納米級相互接近時所附熒光團(tuán)的相互作用來測量活細(xì)胞中兩個分子的直接相互作用。

　　5. 從單個實驗中獲取更多信息

　　總的來說，如果您進(jìn)行活細(xì)胞成像，您可以從單個實驗中獲得比從固定細(xì)胞成像更多的信息。這是因為活細(xì)胞成像使人們能夠跟蹤分子動力學(xué)和動力學(xué)，并提供了您感興趣的一個更大、更全面的細(xì)胞過程圖像。

　　對固定樣本的分析通常只提供某個細(xì)胞性活動的快照，而跟蹤整個動態(tài)過程使人們能夠從單個實驗中測量更多參數(shù)，并得出更多不同的結(jié)論。

　　如您有興趣了解更多關(guān)于活細(xì)胞成像的知識，請關(guān)注我們公眾號活細(xì)胞成像應(yīng)用相關(guān)內(nèi)容。也可以向我們索要相關(guān)資料。

　　活細(xì)胞成像應(yīng)用相關(guān)內(nèi)容：

實時研究生物過程                            活細(xì)胞成像參數(shù)

                 活細(xì)胞成像實驗的要求與設(shè)置                          實驗示例