相差顯微鏡的原理

　　……你是否經常使用相差顯微鏡來觀察你的細胞？

　　……相差顯微鏡是如何工作的？

　　在這篇短片中，我們將向您展示：

　　……為什么這種顯微鏡技術對科學家如此重要?

　　……相位對比如何使幾乎透明的細胞清晰可見?

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　　什么是相差顯微鏡（Phas Contrast Microscopy）?

　　相差顯微鏡是荷蘭科學家澤尼克Zernike于1935年發明的，并于1955年獲得諾貝爾物理學獎。相差顯微鏡是一種特殊的顯微鏡，特別適用于觀察具有很高透明度的對象，例如生物切片、油膜和位相光柵等等。光波通過這些物體，往往只改變入射光波的位相而不改變入射光波的增幅，由于人眼及所有能量檢測器只能辨別光波強度上的差別，也即振幅上的差別，而不能辨別位相的變化，因此用普通顯微鏡是難以觀察到這些物體的。透明度很高的物體，也稱為位相物體。相襯法（也叫位相反襯法）是通過空間濾波器將物體的位相信息轉換為相應的振幅信息，從而大大提高透明物體的可分辨性，該方法使科學家能夠以高水平的細節觀察有機和生物樣品，而不需要進行樣品制備、染色或標記。所以從這個意義上說，相襯法是一種光學信息處理方法，而且是最早的信息處理的成果之一，因此在光學的發展史上具有重要意義。

　　相差顯微鏡和普通顯微鏡的區別是: 用環狀光闌代替可變光闌，用帶相板的物鏡代替普通物鏡，并帶有一個合軸用的望遠鏡。

　　用途

　　相差顯微鏡主要用于觀察未經染色的標本和活細胞。

　　基本原理：

　　相差顯微鏡利用物體不同結構成分之間的折射率和厚度的差別，把通過物體不同部分的光程差轉變為振幅（光強度）的差別，經過帶有環狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實現觀測的顯微鏡。主要用于觀察活細胞或不染色的組織切片，有時也可用于觀察缺少反差的染色樣品。

　　相差顯微鏡把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。光線透過標本后發生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變為1/2λ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減下，提高反差。在構造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡4個特殊之處：

　　1.環形光闌（annular diaphragm） 位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標本上。

　　2.相位板（annular phaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：

　　（1）A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標本結構比周圍介質更加變亮，形成亮反差（或稱負反差）。

　　（2）B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結構比周圍介質更加變暗。

　　3.合軸調節望遠鏡 (centring telescope)：用于調節環狀光闌的像與相板共軛面完全吻合。

　　相差顯微鏡有哪些優點？

　　相位對比顯微鏡的一個重要優勢是可以自然地研究任何活細胞，而不需要固定、標記或染色。

　　該技術產生的所有圖像可以是無標簽的。這也為研究人員節省了時間，并減少了實驗之間出現錯誤或變化的機會。

　　相位對比法對透明樣品效果很好，因為額外的干擾使樣品更加明顯。在這種技術中，整個物體都被照亮了。

　　對于研究活細胞的細胞內成分，相襯顯微鏡提供了相對較高的分辨率。細胞線粒體、有絲分裂的染色體、空泡和其他活細胞成分都可以用這種方法來研究。

　　相差顯微鏡的組件也可以添加到幾乎所有類型的光學顯微鏡中，只要相位物鏡符合顯微鏡的管長參數，聚光器可以與正確尺寸的環形相位環聯姻。這使得它成為一種靈活和廣泛適用的技術。

　　相差顯微鏡要考慮的一個重要問題是什么？以及ibidi提供的解決方式是？