鈣是影響多種細胞過程的重要信使，包括細胞遷移、交流和對刺激物或異物作出反應的能力。由于其在細胞功能中的重要性，細胞內的鈣（稱為細胞內鈣）受到高度調節。鈣主要儲存在細胞器內，例如內質網和線粒體，并根據特定信號釋放。這種緊密的調節使細胞內鈣成為了解細胞功能和信號動力學的絕佳工具。

　　鈣：細胞過程的多功能指示劑

　　有幾種細胞內鈣的熒光指示劑可用于研究細胞功能。這些指標使研究人員能夠檢查傷口愈合、傳染病、藥物治療等過程中的細胞反應。

　　在我們的實驗室中，我們使用鈣信號作為讀數來了解病毒在感染過程中利用宿主信號反應的能力，并剖析所涉及的信號通路。為此，我們利用含有熒光鈣指示劑的細胞的活細胞成像，其中熒光的增加表明細胞內鈣的增加。

　　輪狀病毒感染的非洲綠猴腎細胞(MA104)的活細胞成像。MA104 細胞，以綠色顯示，表達鈣指示劑GCaMP6s，其中綠色增加表示細胞內鈣增加。在這個活體細胞成像視頻中，輪狀病毒感染的細胞呈紅色——Hyser實驗室此前曾報道，在輪狀病毒感染期間，輪狀病毒會導致受感染細胞中的細胞內鈣增加，隨后激活鄰近細胞中的特定信號通路，從而引起未感染細胞的細胞內鈣信號的增加(Chang-Graham et al., 2020)。

　　鈣指示劑的種類及其應用

　　鈣指示劑主要分為兩大類：化學指示劑（即染料）和基因編碼的鈣指示劑（即鈣指示劑被編碼到細胞系、動物模型或系統中）。鈣指示劑已用于使用顯微鏡、高通量篩選和流式細胞術進行體內和體外工作。因而，在此我們將關注使用顯微鏡在體外可視化和量化鈣信號。用于活細胞成像實驗的鈣指示劑類型取決于預期的細胞系、成像長度以及定性或定量數據的預期結果等因素。

　　1.預期細胞系：

　　對于原代細胞系，直接的方法是使用熒光染料（化學指示劑），將熒光鈣指示劑簡單地添加到培養的細胞中，并在孵育期后成像。這些染料也是首次實驗收集初步數據的絕佳方法。使用熒光染料時的一個重要提示是在添加之前和之后徹底清洗細胞，因為染料會導致高背景熒光，使得在顯微鏡和活體成像期間更難以正確聚焦細胞。

　　與基因編碼的鈣指示劑相比，熒光染料通常更亮、更穩定。然而，染料的特異性通常不如遺傳傳感器，并且可能具有更高的背景熒光。在活細胞成像中，熒光染料（包括Fura-2AM、Fluo-4AM、Indo 1AM等）可以有效地進行短期活細胞成像。一個潛在的告誡是，在某些細胞中，細胞可能會保留染料或無法正確加載到某些細胞類型或亞群中。此外，隨著時間的推移，細胞有排出染料的趨勢。雖然添加陰離子轉運蛋白抑制劑可以防止細胞排出染料，但這些抑制劑可能對某些細胞類型可能具有細胞毒性，如果使用其他治療方法評估鈣信號的變化，可能會使情況復雜化。鈣染料的一個重要考慮因素是使用抑制劑還是激動劑。抑制劑和激動劑也可能影響鈣染料反映，類似于在天然組織中的表達。

　　在廣泛的鈣信號傳導實驗中，已建立的細胞系（包括類器官）可以被轉導以表達遺傳編碼的鈣指示劑，如GCaMP、黃色cameleon等。遺傳編碼的鎂指示劑被整合到宿主基因組中，允許細胞正常運作，同時還包括一個基于熒光蛋白的指標，該指標將短暫表達并反映細胞間鈣信號的變化。對現有的不同基因編碼鈣指示劑進行改進，使指示劑更亮，光穩定性更好，動態范圍更大，從而提高了鈣的敏感性。慢病毒轉導是細胞系中使用的一種絕佳的工具，它將允許您選擇的指示劑在細胞系中穩定表達。基因編碼報告系統的一個潛在問題是，并非所有細胞系都容易被轉導。

　　在用ADP 進行激動劑治療期間，人腸道類器官單層的實時、短期成像。這些有機體單層以綠色表達鈣指示劑 GCaMP6s。ADP 是一種已知的激動劑，用于在細胞中引發細胞內鈣信號傳導。激動劑治療是測試治療劑量反應的極好方法。

　　2.成像長度

　　時機就是一切。對于活細胞成像，時間長度和間隔是需要記住的重要參數。成像過程中的主要關注的是光漂白和光毒性。應避免持續使用激發光，重要的是選擇足夠強的曝光時間和光功率，以檢測鈣信號，但不要過強，以免對細胞造成損害。成像的長度將取決于實驗。對于測試激動劑或細胞反應，這通常是5-20分鐘的較短成像運行，每1-2秒捕獲一次圖像。對于研究傷口修復或病毒感染期間鈣信號傳導的實驗，我們會在18-20小時內成像，每分鐘捕捉一次圖像。

　　輪狀病毒感染的非洲綠猴腎細胞(MA104)的活細胞成像。MA104細胞，顯示為綠色，表達鈣指示劑GCaMP6s，其中綠色增加表示細胞內鈣增加。在這個活細胞成像視頻中，輪狀病毒感染的細胞呈紅色——Hyser實驗室之前報道過，在輪狀病毒感染期間，輪狀病毒導致受感染細胞內鈣的增加，并隨后激活鄰近細胞中的特定信號通路，從而引發未受感染細胞的細胞內鈣信號的增加(Chang-Graham et al., 2020)

　　活細胞成像的技巧

　　考慮要使用的細胞系是很重要的。為了研究鈣動力學（或其他細胞信號），使用形成單層的細胞系將確保感興趣的區域保持聚焦，以捕捉信號動力學，從而獲得最佳質量的視頻和清晰的量化。對于涉及細胞間通訊和鈣動力學的實驗，細胞系融合也是一個重要的考慮因素。為了獲得最佳質量的圖像，選擇合適的載玻片非常重要。有些細胞培養物更喜歡玻璃載玻片而不是光學級塑料載玻片，因此最好測試腔室載玻片。我們的細胞系使用ibiTreat μ-Slide 8 Well high八孔高壁腔室載玻片。

　　μ-Slide 8 Well high（貨號: 80806）

　　對于活細胞成像，重要的是要使細胞的密度允許形成一個融合的單層，但不會導致細胞過度擁擠和團塊。最后一個技巧是在成像過程中使用合適的培養基。許多傳統的細胞培養基含有酚紅，它可引起高背景熒光。這使得在成像過程中很難從背景噪聲中分離出真實信號。因此，重要的是用PBS洗滌細胞，并用無酚紅培養基或市售的用于活細胞成像的培養基代替培養基。

　　Thapsigargin治療前后非洲綠猴腎細胞（MA104）的活體短期成像。MA104細胞，顯示為綠色，表達鈣指示劑GCaMP6s，其中綠色的增加表示細胞內鈣的增加。Thapsigargin是一種眾所周知的肌肉/內質網Ca2+-ATP酶抑制劑（對從胞質溶膠中螯合鈣很重要）。通過這種抑制，Thapsigargin誘導內質網應激，并可導致源自內質網的細胞內鈣增加。

　　參考文獻

　　Chang-Graham AL, Perry JL, Engevik MA, Engevik KA, Scribano FJ, Gebert JT, Danhof HA, Nelson JC, Kellen JS, Strtak AC, Sastri NP, Estes MK, Britton RA, Versalovic J, Hyser JM. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 2020 Nov 20;370(6519):eabc3621. doi: 10.1126/science.abc3621.