免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法用小玻片，先泡酸、再晾干、再 coating、再種細(xì)胞、染色、封片成像。

　　本文章介紹新方法，我們將描述在通道載玻片內(nèi)培養(yǎng)大鼠成纖維細(xì)胞（Rat1）的單個(gè)實(shí)驗(yàn)案例。然后，我們用AlexaFluor®488鬼筆環(huán)肽染色F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，并用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。

　　該實(shí)驗(yàn)包括四個(gè)主要步驟：

　　實(shí)驗(yàn)所需材料：

　　• HT1080細(xì)胞懸浮液（180μl；3x10⁵ 細(xì)胞/ml）

　　• 具有10% FCS的DMEM

　　• μ-Slide VI^0.4，ibiTreat底部處理（ibidi #80606）

　　• Dulbecco′s PBS

　　• PBS中3.7%多聚甲醛（PFA）

　　• 0.1% Triton® X-100

　　• PBS中的1% BSA

　　• Alexa Fluor® 488鬼筆苷（0.165 μM）

　　• DAPI（0.1 μg/ml）

　　• ibidi封片劑（ibidi #50001）

　　• 可選：ibidi浸漬油（ibidi #50101）

　　1、培養(yǎng)

　　• 在無菌條件下打開 μ-Slide VI ^0.4、ibiTreat (80606) 的包裝，并將其放在 μ-Slide 架 (80003) 上。

　　• 在每個(gè)通道中加入 30 μl 3x10⁵細(xì)胞/ml 大鼠成纖維細(xì)胞（Rat1）細(xì)胞懸液。如下圖所示或我們的網(wǎng)站上所示，直接將移液器加入通道。

　　• 用隨附的蓋子蓋住。

　　• 將載玻片放入培養(yǎng)箱 (37 °C; 5% CO2) 培養(yǎng)并讓細(xì)胞附著 (60 分鐘)。然后用 60 μl 無細(xì)胞培養(yǎng)基填充兩個(gè)通道口。

　　• 孵育過夜。

　　2、固定和透化

　　在固定和透化過程中要小心，通道永遠(yuǎn)不要變干！通過用下一個(gè)沖洗剩余的溶液來交換通道中的液體

　　固定：

　　• 使用細(xì)胞培養(yǎng)抽吸裝置從所有通道口中吸出培養(yǎng)基。用 Dulbecco PBS 洗滌細(xì)胞，方法是將 200 μl 緩慢加入每個(gè)通道的一個(gè)空通道口，并從每個(gè)通道的相對(duì)通道口吸出。不要吸出整個(gè)通道體積。

　　• 用約 100 μl 3.7% 多聚甲醛的 PBS 固定細(xì)胞。20 分鐘后，通過用 200 μl PBS 填充一孔并從另一孔中吸出來沖洗通道內(nèi)的液體；確保通道永不干涸。

　　透化和封閉：

　　• 如上所述，用 200 μl PBS 再次洗滌細(xì)胞。

　　• 在 PBS 中用 ~100 μl 0.1% Triton® X-100 3-5 分鐘。

　　• 用 PBS 洗滌細(xì)胞。

　　• 用 ~100 μl 封閉溶液（PBS 中的 1% BSA）20 分鐘。

　　• 用 PBS 洗滌細(xì)胞。

　　3、染色

　　• 使用抽吸裝置從通道中取出所有液體。不要讓通道變干。

　　• 吸液后立即加入 30 μl Alexa Fluor® 488 鬼筆環(huán)肽（在 200 μl PBS 和 1% BSA 中）。用 1 毫升注射器注射溶液會(huì)有所幫助。在室溫下孵育 20 分鐘。

　　• 用 PBS 洗滌細(xì)胞。

　　• 用 30 μl DAPI (0.1 μg/ml) 3-5 分鐘。

　　• 用 PBS 清洗細(xì)胞并應(yīng)用 ibidi 封固培養(yǎng)基，直到通道被填滿（約 50 μl）。ibidi 封固劑以甘油為基礎(chǔ)，并含有用于抗褪色的 DABCO。載玻片可存放約4 周。

　　4、成像

　　在熒光顯微鏡下選擇適當(dāng)?shù)臑V鏡，也可以使用浸油觀察細(xì)胞。

　　之所能如此簡(jiǎn)便完成免疫熒光實(shí)驗(yàn)，是因?yàn)檫@些ibidi培養(yǎng)皿和載玻片的底部為特殊處理的材質(zhì)，絕大多數(shù)細(xì)胞可以直接貼壁生長(zhǎng)，而不需要另外包被。同時(shí)，這些耗材的底部薄如蓋玻片，可以直接使用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，得到高質(zhì)量的成像，適用于顯微鏡比如共聚焦顯微鏡。

　　實(shí)驗(yàn)例子

　　超分辨率顯微鏡 (STED)觀察肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架

　　μ-Slide VI ^0.4與超分辨率顯微鏡方法兼容，使用 LifeAct-TagGFP2 蛋白，可以詳細(xì)觀察肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，固定的 Rat1 成纖維細(xì)胞與 LifeAct-TagGFP2 蛋白一起在 μ-Slide VI ^0.4，ibiTreat中孵育。并用 STED 顯微鏡以創(chuàng)建超分辨率圖像。

　　使用LifeAct-TagGFP2 蛋白對(duì) Rat1 成纖維細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架進(jìn)行超分辨率顯微鏡檢查。使用 Plan-Neofluar 100x/1.4 物鏡在 STEDYCON 超分辨率 STED 納米顯微鏡系統(tǒng)（Abberior Instruments GmbH，德國(guó)哥廷根）上進(jìn)行顯微鏡檢查。

　　μ-Slide VI ^0.4用于獲取人 BJ 成纖維細(xì)胞的共聚焦圖像。用 Drp-1 siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞并用 MitoTracker Red 染色以觀察融合的線粒體。

　　在 ibidi μ-Slide VI ^0.4中培養(yǎng)的人 BJ 成纖維細(xì)胞的共聚焦顯微鏡圖像。MitoTracker Red（紅色）用于可視化線粒體。圖片由土耳其伊斯坦布爾哈里克大學(xué)醫(yī)學(xué)院的 Fulya Dal Yontem 提供。

　　用于肌動(dòng)蛋白可視化的熒光顯微鏡

　　在這個(gè)例子中，A549 細(xì)胞（肺泡上皮細(xì)胞）在 μ-Slide VI ^0.4，ibiTreat上培養(yǎng)，以研究促炎刺激對(duì)細(xì)胞骨架重排的影響。將細(xì)胞暴露于內(nèi)毒素 (LPS) 中 4 小時(shí)，并用熒光鬼筆環(huán)肽染色以觀察細(xì)胞收縮和細(xì)胞間間隙的出現(xiàn)。

　　A549 細(xì)胞在 μ-Slide VI ^0.4、ibiTreat 上生長(zhǎng)，暴露于內(nèi)毒素 (LPS) 4 小時(shí)，并用熒光鬼筆環(huán)肽染色以檢測(cè)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白（紅色）。40 倍放大倍率。圖片由美國(guó)弗吉尼亞州里士滿弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)的 Bernard Fisher 提供。