細胞趨化實驗原理

　　定義：趨化性（Chemotaxis，亦被稱為化學趨向性）是趨向性的一種，指身體細胞、細菌及其他單細胞、多細胞生物依據環境中某些化學物質而趨向的運動。這對細菌尋找食物 (如葡萄糖) 十分重要，細菌以此趨進有較高食物分子濃度的地方，或遠離有毒 (如苯酚) 的地方。在多細胞生物中，趨化性對其發展和其他正常功能一樣不可或缺。正趨化性指趨向較高化學物質濃度的運動，而負趨化性則相反。

　　下面，我們介紹一個使用ibidiμ-Slide Chemotaxis3D分析嵌入3D牛膠原蛋白基質中的小鼠樹突狀細胞的趨化性的詳細實驗方案。

　　使用ibidiμ-Slide Chemotaxis細胞趨化載玻片的化學趨化實驗，可以實時觀察記錄細胞的趨化行為。

　　一、實驗材料準備

　　1）儀器：

　　細胞培養箱（高濕度，37℃，5%CO2）

　　帶定時拍照功能的倒置相差顯微鏡

　　鏡載加熱孵育系統（37℃，5%CO2）

　　可選配置：全自動載物臺，自動對焦系統（x，y，z），可平行觀察3個腔室和多達4個玻片。

　　分析軟件：ImageJ插件“手動跟蹤”和“ibidi的趨化和遷移工具

　　注意：低倍率物鏡（4x-10x）提供了更大的聚焦深度，因此是有利的。

　　2）樹突細胞的培養：

　　樹突狀細胞(第8-10天)應用200 ng/ml LPS(在細胞培養基中，如表1所示)過夜激活。

　　表一：樹突細胞培養所需的試劑和培養基

　　3）基質膠制備，Collagen I，bovine，1.6mg/ml

　　樹突狀細胞的化學趨化實驗所需的耗材和試劑（如下表二）：

　　表二：化學趨化需要的耗材和試劑

　　表三：1.5 mg/ml牛膠原蛋白I凝膠的組成

　　操作步驟：

　?、?使用表一中的培養基制備9 x 106 cells/ml的細胞懸液

　?、?在1.5ml離心管中小心混勻表三中的成分1，2，3和4，避免產生氣泡

　?、?在另一1.5ml離心管中準備150μl的膠原蛋白（成分5）

　　④ 使用200μl槍頭將步驟2中的100µl混合物轉移到膠原蛋白管中（圖一A）

　?、菪⌒幕靹颍▓D一B），務必避免產生氣泡

　?、?向混合液中加入50μl細胞懸液（圖一C）

　　⑦ 小心混勻（圖一D），務必避免產生氣泡

　?、?隨后，立即將混合物填充到通道中

　?、?將載玻片放入培養箱45分鐘使其凝固。之后，膠原纖維就會顯現出來。

　　二、細胞趨化實驗

　　1）趨化試劑：

　　化學趨化物：CCL19 (1.25 µg/ml in RPMI 1640 supplemented with 10%FCS)

　　無化學趨化物培養基：RPMI 1640 supplemented with 10% FCS

　　操作步驟：

　　① 凝膠凝膠化后，用不含化學趨化物或含化學趨化物的培養基加入細胞趨化載玻片的儲液池中。

　?、?用65µl含有化學趨化物的培養基填充一個儲液池，用65μl無化學趨化物培養基填充另一個儲物池作為細胞趨化實驗（+/-）。

　?、?作為對照實驗（-/-），用65µl無化學趨化物培養基填充兩個儲液池。

　　④ 按說明，將通道加液孔用塞子塞緊后可以進行圖像采集。

　?、?將載玻片置入鏡載加熱孵育系統中。

　?、?調整好采集位點，進行4小時的觀測，每2分鐘采集一張圖片。

　　圖1.顯微鏡觀察：由于3D環境，并非所有細胞都能完全聚焦，這取決于所使用的物鏡

　　三、實驗結果

　　如果滿足以下參數并具有統計學相關性，則可以假設細胞定向遷移:

　　1）趨化實驗的FMIII值大于fmii值，且p值<0.05;

　　2）各對照實驗的FMIII和fmil應在零左右，p值應為p>0.05。

　　表四：HT1080細胞遷移參數比較。趨化性實驗和對照實驗的數據如下表所示。CCL19作為化學趨化物

　　當使用CCL19作為化學引誘劑時，可觀察到趨化反應。趨化實驗的FMIII和p值(瑞利檢驗的p值)都表明有定向細胞遷移。相反，在沒有CCL19(對照實驗)的情況下，可以觀察到隨機遷移。

　　圖2. 在1.5mg/ml膠原凝膠中培養的樹突狀細胞的代表性細胞軌跡圖。給出了趨化性實驗（a）和對照實驗（b）的結果