1.概述

　　在延時實驗期間確保活細胞成像裝置的機械穩(wěn)定性非常重要。電動載物臺的位置恢復(fù)中的振動效應(yīng)或容差會導(dǎo)致圖像序列的（輕微）偏移。每個外部運動都可以覆蓋觀察到的細胞運動。當(dāng)使用更高的放大倍數(shù)或處理緩慢遷移的細胞時，這一點尤為重要，因為每個細胞所覆蓋的距離相對較小。本應(yīng)用說明將介紹一種計算外部引起的像素偏移的方法，然后將其從細胞軌跡坐標(biāo)中減去。所得數(shù)據(jù)總結(jié)了實際的細胞遷移參數(shù)。

　　2.應(yīng)用實例

圖 1. 在實驗過程中，stage top incubator位移產(chǎn)生了約90像素的永久像素偏移

　　圖1顯示了對圖像序列中像素偏移進行校正的需要。在進行實驗時，stage top incubator的位移產(chǎn)生了約90像素的永久像素偏移。繪制細胞軌跡（圖2）和分析遷移參數(shù)（表1）給出了定向細胞遷移的錯誤印象。然而，將像素偏移納入數(shù)據(jù)分析表明，明顯存在的定向細胞遷移僅由像素偏移產(chǎn)生。

　　所給出的方法不僅適用于補償一個大的像素偏移，而且也可以用于整個測量過程中可能發(fā)生的小偏移。

圖2. 0到24小時內(nèi)40個細胞的軌跡圖。左圖顯示未校正數(shù)據(jù)，右圖顯示校正數(shù)據(jù)

　　表1. 未校正數(shù)據(jù)與校正數(shù)據(jù)偏移參數(shù)對比,獲得的未校正軌跡值表明定向細胞遷移，即使這僅歸因于現(xiàn)有的像素偏移。

　　3.原理

　　在圖像序列中，校正像素偏移需要幾個工作步驟：

　　1. 跟蹤每次時間間隔測量的30到40個細胞。例如，我們建議使用ImageJ插件手動跟蹤。該插件能夠量化對象在時間堆棧的幀之間的移動。

　　2. 每個趨化室都需要一個參考軌道。必須在整個圖像序列進行跟蹤剛性點，例如通道邊界的定義位置。當(dāng)使用膠原纖維作為剛性點時，請確保不會因細胞運動產(chǎn)生的張力而發(fā)生纖維運動。參考軌跡的第一幅圖像用作比較值（Xref,1 和 Yref1）。必須計算所有后續(xù)圖像（Xshift,i 和Yshift,i）和比較值之間的像素偏移（Xref,i 和 Yref,i）。

　　3. 更正你的細胞軌跡。獲得的每幅圖像的軌跡坐標(biāo)（Xi和Yi）必須通過計算出的像素位移進行校正。這是通過從原始數(shù)據(jù)細胞軌跡坐標(biāo)中減去像素位移來執(zhí)行的。因此，需要復(fù)制細胞格軌跡數(shù)據(jù)并將參考軌跡數(shù)據(jù)粘貼到同一個Excel文件中（圖3）。

　　4. 將校正后的值復(fù)制到新的Excel文件中。此文件應(yīng)另存為excel（.xls 或 .xlsx）和文本文檔 (.txt)。exel文件允許進行后續(xù)更改，而文本文件可以導(dǎo)入趨化和遷移工具（ibidi提供的免費軟件），用于繪制數(shù)據(jù)和分析趨化效應(yīng)。

圖3. 圖像序列中小像素偏移校正的示例計算。計算每個參考圖片的像素偏移并從原始數(shù)據(jù)中減去以獲得校正后的軌跡坐標(biāo)

　　5. 檢查獲得的值正確性。使用趨化和遷移工具打開原始以及更正后的跟蹤文件，以檢查您是否僅更正了數(shù)據(jù)，而沒有錯誤地創(chuàng)建人工細胞運動（圖4）。圖4中顯示的人工細胞運動歸因于跟蹤細胞時對像素偏移的延遲反應(yīng)。與參考軌跡相比，這種延遲反應(yīng)無法通過這種方法進行補償。

圖4 . 測試數(shù)據(jù)更正很重要。左圖顯示未經(jīng)校正的原始數(shù)據(jù)，中間圖顯示像素位移校正數(shù)據(jù)，右圖顯示人工創(chuàng)建的細胞運動。