熒光肌動蛋白染色，特別是使用phalloidin，通過顯微鏡深入了解細(xì)胞結(jié)構(gòu)和過程的一種強大方法。這種方法可以對肌動蛋白絲進行特定的可視化，使熒光肌動蛋白染色成為科學(xué)家解答許多與細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)問題（包括細(xì)胞骨架組織和動力學(xué)）的不可或缺的工具。

　　本實驗方案中，我們提出了一種使用µ- slide VI ^0.4六通道載玻片培養(yǎng)和對粘附性人纖維肉瘤細(xì)胞系HT-1080肌動蛋白熒光染色的簡便方案。

　　請注意: 在開始肌動蛋白熒光染色之前必須檢查幾個重要的參數(shù)，如最佳細(xì)胞密度，理想的細(xì)胞培養(yǎng)器皿及底部/涂層。此外，陽性和陰性對照是驗證染色的必要條件。因此，我們強烈建議在實驗前進行充分的文獻(xiàn)研究。

　　1. 材料

　　1.1. 試劑和緩沖液

　　細(xì)胞培養(yǎng)

　　• HT-1080細(xì)胞(85111505, Sigma Aldrich)

　　• 細(xì)胞培養(yǎng)基: DMEM (D6546, Sigma Aldrich)，含10%胎牛血清 (F1283, Sigma Aldrich)

　　• D-PBS (14190144, Gibco)

　　• Accutase (A1110501, Gibco)

　　熒光染色與成像

　　• D-PBS (14190144, Gibco)

　　• 福爾馬林，10%，當(dāng)即可用 (HT5011, Sigma Aldrich)

　　• Triton-X-100 (A16046, Thermo Fisher Scientific)

　　• 滲透性緩沖液 (0.1% Triton-X-100 in D-PBS)

　　• 牛血清白蛋白 (BSA) (A1470-10G, Sigma Aldrich)

　　• 封閉緩沖液 (1% BSA in D-PBS)

　　• Phalloidin溶液:1µl Phalloidin- ifluor 488 Reagent (ab176753, Abcam)在1 ml封閉緩沖液中

　　• ibidi封片劑，含DAPI (50011, ibidi)

　　• ibidi浸漬油 (50101, ibidi)

　　1.2. 設(shè)備

　　• µ-Slide VI^0.4 ibiTreat (80606, ibidi)

　　• µ-Slide支架 (80003, ibidi)

　　• 標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備(移液槍，超凈工作臺，細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)基，血細(xì)胞計等)

　　• 倒置熒光顯微鏡與適配的濾光片組

　　2. 方法

　　2.1. 細(xì)胞培養(yǎng)

　　在使用μ -Slide VI^0.4之前，請閱讀使用說明書。在無菌條件下進行所有步驟。建議在細(xì)胞接種前一天將

　　µ-Slide VI0.4和細(xì)胞培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中，以避免處理過程中形成氣泡。在開始實驗之前，在具有粘附細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)底的細(xì)胞培養(yǎng)瓶（例如T75）中制備HT-1080細(xì)胞。理想情況下，在實驗當(dāng)天，細(xì)胞應(yīng)該是低融合和健康的。

　　在整個過程中迅速工作是至關(guān)重要的，以防止細(xì)胞干涸。

　　如未另行說明，所有給定的體積都是單通道的，所有培養(yǎng)步驟都是在室溫下進行的。

　　• 將10ml Accutase加入T75培養(yǎng)瓶中進行細(xì)胞分離；在培養(yǎng)箱（37°C，5%CO₂）中培養(yǎng)5分鐘。

　　• 收集細(xì)胞懸液，離心，并將其稀釋在少量細(xì)胞培養(yǎng)基中進行計數(shù)。

　　• 計數(shù)細(xì)胞，并在細(xì)胞培養(yǎng)基中調(diào)整到最終濃度為3 × 10⁵ cells/ml。

　　• 打開ibidi µ-Slide VI^0.4，并將其放在µ-Slide支架或合適的表面上。

　　• 將30µl HT-1080細(xì)胞懸液移液填充到每個通道中。快速填充有助于避免截留氣泡。

　　• 通過傾斜µ-Slide通道載玻片并輕敲一側(cè)邊緣，清除通道中截留的氣泡。

　　• 用隨附的蓋子蓋上儲液池。

　　• 將µ-Slide通道載玻片與支架放入培養(yǎng)箱(37 °C, 5 % CO₂)，讓細(xì)胞附著 ( 1小時)。

　　• 在每個儲液池中加入60µl無細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基。避免截留氣泡。

　　• 將µ-Slide通道載玻片與支架放入培養(yǎng)箱(37 °C, 5 % CO₂)，并將細(xì)胞孵育過夜。

　　•  就延長細(xì)胞培養(yǎng)，建議每兩天連續(xù)更換一次培養(yǎng)基(詳見如下2.2)。

　　2.2.  連續(xù)更換培養(yǎng)基

　　• 小心地從儲液池中抽吸培養(yǎng)基。不要從通道中吸入任何液體。

　　• 輕輕地將120µl無細(xì)胞培養(yǎng)基導(dǎo)入一個儲液池中，使通道得以補充。

　　• 從對面的儲液池中抽吸舊的培養(yǎng)基。使用細(xì)胞培養(yǎng)抽吸裝置時要小心，因為這可能會吸走部分附著的細(xì)胞或細(xì)胞簇。

　　• 每個儲液池使用60µl無細(xì)胞培養(yǎng)基重新填充儲液池。

以最小容量為通道容量的三倍連續(xù)更換培養(yǎng)基

　　2.3. 固定, 透化和封閉

　　• 快速執(zhí)行所有步驟，確保通道不會干涸。為實驗準(zhǔn)備足夠的滲透緩沖液和封閉緩沖液。

　　• 通過連續(xù)的培養(yǎng)基交換用D-PBS代替細(xì)胞培養(yǎng)基進行洗滌。

　　• 抽吸大部分D-PBS。不要全部吸出。

　　• 用100µl福爾馬林（10%）固定細(xì)胞20分鐘。

　　• 連續(xù)換液，用200µl D-PBS洗滌細(xì)胞3次。

　　• 抽吸大部分D-PBS。不要全部吸出。

　　• 在100µl滲透緩沖液中孵育細(xì)胞5分鐘。

　　• 用200µl D-PBS連續(xù)換液清洗細(xì)胞。

　　• 抽吸大部分D-PBS。不要全部吸出。

　　• 用100µl封閉緩沖液封閉20分鐘。

　　• 用200µl D-PBS清洗細(xì)胞。

　　2.4.  染色

　　• 從儲液器和通道中吸出所有D-PBS。使用5毫升注射器填充空通道，以盡量減少引入氣泡的風(fēng)險。

　　• 立即將30µl的phalloidin溶液加入通道中; 在暗處培養(yǎng)20分鐘。樣品應(yīng)盡可能放在暗處保存。

　　• 連續(xù)交換培養(yǎng)基，用200µl D-PBS洗滌細(xì)胞2次。

　　2.5.  封片

　　•  吸取所有D-PBS，立即加入ibidi含DAPI的封片劑進行核染色，直到通道被填滿。如果使用不同的封片劑，請注意它必須是非干燥的，以避免損壞µ-Slide。

　　•  在4°C暗處儲存，直到成像。

　　•  染色后的µ-Slide可保存4周。理想情況下，應(yīng)立即進行成像，因為較長的存儲時間會降低圖像質(zhì)量。

　　2.6.  成像

　　•  在熒光顯微鏡下用適當(dāng)?shù)臑V光片組觀察細(xì)胞，必要時用ibidi浸漬油。

　　• 可選，疊加圖像以創(chuàng)建合并圖像。

　　3. 結(jié)果

　　HT1080細(xì)胞在µ-Slide VI ^0.4通道載玻片中的寬場熒光顯微成像。使用phalloidin(綠色)觀察F-actin細(xì)胞骨架。細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）染色。使用Plan Neofluar 40x/0.75物鏡在蔡司Axiovert 135顯微鏡上進行成像。

　　您的熒光染色結(jié)果如果沒有您預(yù)期的那樣？請參閱 immunofluorescence troubleshooting guide